中国中医科学院研究生，中国中医科学院研究生院
溃疡性结肠炎（ ulcerative colitis ，UC ）按照病情严重程度分为活动期和缓解期，活动期临床表现为持续或反复发作的腹泻、黏液脓血便伴腹痛、里急后重和不同程度的全身症状，病程多在4 ～6 周以上[1] ；缓解期一般无症状（排便次数正常且无血便和里急后重），并且内镜复查见肠黏膜正常或无活动性炎症[2] 。研究表明，超过20% 的UC 患者会在30 年内发展为致死率高达50% 的炎症性结肠癌[3] 。
铁死亡是一种新发现的细胞程序性死亡形式，主要由铁介导的氧化损伤、脂质过氧化和细胞膜损伤驱动 [4] 。铁是人体元素之一，铁离子和亚铁离子的平衡是维持身体正常生理功能必不可少的条件，一旦平衡被破坏，亚铁离子的羟基自由基可通过Fenton 反应催化产生大量的脂质活性氧（reactive oxygen species ，ROS ），从而促进过度脂质氧化导致铁死亡[5-6] 。多项研究证实ROS 和铁在UC 病情发展过程中起重要作用[7-8] 。铁死亡的基本特征包括铁减少、脂质过氧化、谷胱甘肽（glutathione ，GSH ）减少、磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase 4 ，GPX4 ）失活和脂氧合酶（lipoxygenase ，LOX ）增加，这些特征已被证实与UC 的发病机制相关，并且在UC 小鼠模型中也观察到了铁死亡现象[9-13] 。有研究者发现铁死亡通过内质网（endoplasmic reticulum ，ER ）应激介导的肠上皮细胞（intestinal epithelial cell ，IEC ）死亡从而导致UC ，并且认为铁死亡是UC 的潜在治疗靶点[14] 。
目前天然活性成分干预铁死亡的研究较少，但研究前景广阔 [15] 。已有研究显示黄芪多糖能明显抑制ROS 的产生[16] ；蒿甲醚通过抑制肝星状细胞活化从而抑制肝硬化铁死亡[17] ；青蒿素可调节铁相关基因，通过促进ROS 聚集诱导白血病细胞CCRF-CEM 铁死亡[18] 。但目前鲜有药物通过干预铁死亡来治疗UC 的研究，本研究希望能通过生物信息学从铁死亡角度明确UC 不同时期的表达靶点并筛选可能具有干预UC 作用的天然药物，以期为UC 的临床治疗提供思路。
1 资料和方法
1.1UC数据集收集及疾病靶点差异分析
通过在 GEO 数据库（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/gds/ ）中检索与UC 相关的数据集，以样本量大于10 ，同时包含正常样本、UC 活动期及缓解期样本为筛选标准。将筛选得到的数据集矩阵进行规范化数据整理后，通过Bioconductor 下载limma 程序包，运用R 软件对数据集中的靶点进行limma 差异分析，设置错误发现率（false discovery rate ，FDR ）＜0.05 ，表达差异倍数（fold chang ，FC ）＞0.5 ，得到差异基因。
1.2 铁死亡相关靶点收集
FerrDb 平台是一个收集铁死亡调节因子、标记因子及与铁死亡关联疾病的数据库。通过FerrDb 平台（http://www.zhounan.org/ferrdb/ ）收集与铁死亡相关的靶点，包括铁死亡驱动因子、抑制因子、标记因子3 种。
1.3 铁死亡与UC共同靶点的蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络
将收集得到的铁死亡相关靶点与 UC 相关靶点取交集，得到铁死亡与UC 之间的共同靶点。将上述共同靶点导入STRING10.0 数据库（https://string-db.org/ ），设置物种为“humo sapiens ”，得到铁死亡与UC 靶点的PPI 网络。将网络图以tsv 的格式导入Cytoscape 进行美化，并对其进行拓扑学特征分析，通过Cytoscape 的插件CytoNCA 计算参数来评价网络中每个节点在功能上的重要性，筛选参数分别为中间中心性、接近中心性和度中心性 。上述3 个典型的中心属性参数可以评价网络节点的重要性，值越大说明节点越接近网络中心位置。筛选排名前10 的靶点作为核心靶点。
1.4 铁死亡与UC不同时期共同靶点的基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析
GO 富集从3 个角度对基因进行分类，分别为生物过程（biological process ，BP ）、分子功能（molecular function ，MF ）和细胞组分（cellular component ，CC ），可以从不同的层面解释基因的生物学功能。KEGG 是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库，常应用于基因的功能注释以了解其相关功能与作用通路。为了进一步了解铁死亡与UC 不同时期的靶点功能以及在信号通路中的作用，通过Bioconductor 下载clusterProfiler 程序包，运用R 软件分别对UC 活动期与缓解期的相关靶点进行GO 及KEGG 富集分析，设定阈值P ＜0.05 。
1.5CMap数据库筛选通过铁死亡治疗UC的天然活性成分
通过 Connectivity map 关联性图谱CMap clue 平台（https://clue.io/ ）定位天然活性分子。CMap 平台可用于建立药物- 基因- 疾病之间的联系。通过统计比较与疾病基因的表达谱，可得到相关天然活性成分，并给予 − 1 到1 之间的分数。天然活性成分通常与疾病之间呈负相关关系，其分数的绝对值越接近于1 则代表该成分对疾病更可能有治疗作用。将通过差异分析得到的靶点及收集得到的铁死亡靶点取交集得到共同关键靶点，将这些关键靶点按照在UC 活动期、UC 缓解期中上调表达、下调表达进行分类，分别命名为“up signature ”及“down signature ”以txt 的格式导入CMap clue 后得到结构，结果以FDR ≤0.01 筛选，并按照score 大小排序。将所有符合条件的活性成分在TCMSP （https://old.tcmsp-e.com/index.php ）中进一步检索获得其对应中药。
1.6 核心靶点与活性成分的分子对接
分子对接技术通过分子之间的空间识别和能量识别，利用计算机来模拟分子间的相互作用关系。通过 PDB 数据库（https://www.rcsb.org/ ）下载核心靶点的配体和受体的3D 结构。核心靶点基因的蛋白质晶体结构经去水、加氢、模拟缺失环区域，计算蛋白质电离，对蛋白质结构进行质子化的预处理。活性对接箱由原配体和结合位点球确定。利用Vina 开源程序（http://vina.scripps.edu/ ）进行对接，并根据结合亲和力值评价靶点与活性化合物的结合强度与活性。
2 结果
2.1UC疾病靶点与铁死亡靶点收集
通过 GEO 数据库检索与UC 相关的数据集，筛选确定GSE53306 、GSE38713 、GSE11223 数据集。GSE53306 数据集标题为“Differential gene expression between active and quiescent stages of ulcerative colitis: Insights into a distinctive pathogenesis profile ”，该数据库包含样本量40 例，UC 活动期样本16 例，UC 缓解期样本12 例，正常对照样本12 例，其发表于2014 年12 月13 日，最后更新于2017 年12 月22 日。GSE38713 数据集标题为“Expression data from intestinal mucosa of patients with UC ”，该数据库包含样本量43 例，UC 活动期样本15 例，UC 缓解期样本15 例，正常对照样本13 例，其发表于2012 年11 月9 日，最后更新于2019 年3 月15 日。GSE11223 数据集标题为“Colon biopsies from UC patients and healthy controls ”，该数据库包含样本量198 例，UC 活动期样本63 例，UC 缓解期样本66 例，正常对照样本69 例，其发表于2008 年4 月21 日，最后更新于2017 年4 月12 日。将筛选出的数据集下载导出并进行数据的去重规范处理后运用R 软件的limma 程序包进行差异分析，UC 活动期样本得到差异表达靶点3985 个，UC 缓解期样本得到差异表达靶点659 个。通过FerrDb 平台共收集得到铁死亡相关靶点388 个。
2.2UC不同时期差异表达与铁死亡共同靶点PPI构建
将收集得到的铁死亡相关靶点分别与 UC 不同时期差异表达靶点取交集，导入STRING11.0 数据库，得到与铁死亡相关的UC 差异表达靶点间的PPI ，包含68 个靶标蛋白及171 条蛋白相互作用。运用CytoNCA 插件对PPI 网络进行拓扑学特征分析，中心属性参数选用中间中心性、接近中心性和度中心性评价网络节点的重要性。筛选排名前10 的靶点作为核心靶点，将核心靶点颜色标黄，其余靶点环绕核心靶点按圆周排列并将颜色标为蓝色（图1 、2 ）。核心基因为白细胞介素-6 （interleukin-6 ，IL-6 ）、缺氧诱导因子-1α （hypoxia inducible factor-1α ，HIF1A ）、白细胞介素-1β （interleukin-1β ，IL-1β ）、过氧化物酶体增殖物活化受体（peroxisome proliferator-activated receptor α ，PPARA ）、葡萄糖转运蛋白1 （solute carrier family 2 member 1 ，SLC2A1 ）、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1 （NADPH oxidase 1 ，NOX1 ）、白细胞分化抗原44 （cluster of differentiation 44 ，CD44 ）、内质网应激蛋白1 （x-box binding protein 1 ，XBP1 ）、有丝分裂原活化蛋白3 激酶5 （mitogen-activated protein 3 kinase 5 ，MAP3K5 ）、双微粒体2 （mouse double minute 2 ，MDM2 ）。 核心基因的拓扑学特征见表 1 。
2.3 铁死亡与UC不同时期共同靶点的GO及KEGG富集分析
将通过筛选得到的铁死亡与UC 不同时期差异表达的共同靶点进行GO 及KEGG 富集分析。运用R 软件中的Cluster Profiler 包，分别对铁死亡与UC 活动期、缓解期的共同靶点进行GO 富集分析，设定阈值P ＜0.05 并根据P 值从小到大分别绘制BP 、CC 、MF 层面排名前20 的GO 富集分析图（图3 ）。UC 活动期在BP 中与刺激的反应相关性较高，其中外界刺激、饥饿、营养水平、氧化应激等反应相对靠前；在CC 中膜、核所占比例较大；在MF 中蛋白结合 占比较大。UC 缓解期在BP 中细胞解毒的反 应、过氧化物的代谢相对靠前， CC 和 MF 部分由于核心靶点较少，无法获取结果。运用 R 软件中的 cluster Profiler 程序包，分别对铁死亡与 UC 活动期、缓解期的共同靶点进行 KEGG 富集分析，设定阈值 P ＜ 0.05 ，并导出条目的 ID 号、 P 值和名称。根据 P 值从小到大排序绘制 KEGG 富集气泡图（图 4 ）。
在信号通路方面，神经退行性疾病 – 多种疾病通路（ pathways of neurodegeneration-multiple diseases ）是 UC 活动期与缓解期的共同信号通路。 UC 活动期排序前 5 并与缓解期不同的信号通路分别是酒精性肝病（ alcoholic liver disease ）、铁死亡（ ferroptosis ）、脂质和动脉粥样硬化（ lipid and atherosclerosis ）、 NOD 样受体信号通路（ NOD-like receptor signaling pathway 。 UC 缓解期与活动期不同的信号通路分别是甲状腺激素合成（ thyroid hormone synthesis ）、阿米巴痢疾（ amoebiasis ）。
2.4 通过铁死亡治疗UC的天然药物成分 筛选
通过差异分析，发现 UC 缓解期的上调靶点有301 个，下调靶点有357 个；UC 活动期的上调靶点有2023 个，下调靶点有1961 个。将分析得到的UC 活动期与缓解期的关键上调和下调靶点导入 CMap 数据库平台，设置 FDR ≤ 0.01 ，并筛选呈负相关的小分子化合物。从小分子化合物中通过 TCMSP 数据库筛选天然活性成分，结果显示大豆苷元、芦丁、胡椒碱、白藜芦醇、杨梅素、苦参碱、槲皮素、黄体酮、染料木素、大黄素为最有可能治疗 UC 的活性成分。通过 TCMSP 数据库探寻天然活性成分所来源的中药，发现有多种天然药物含有这些核心成分。山豆根含有大豆苷元、芦丁、苦参碱、染料木素和大黄素；川牛膝含有大豆苷元、芦丁、槲皮素；连翘含有芦丁和杨梅素；败酱草、白花蛇舌草、白果和北沙参均含有芦丁和槲皮素（表 2 ）。
2.5 核心靶点与药物小分子的分子对接
将核心靶点导入 TCMSP 数据库，检索核心靶点与天然活性成分的匹配关系，筛选条件设置为至少同时与3 种上述所预测的活性成分匹配，最终得到IL-6 、IL-1β 、CD44 3 个靶点。通过PDB 数据库筛选靶点IL-6 （PDB ID:4o9h ）、IL-1β （PDB ID:6y8m ）、CD44 （PDB ID:1uuh ）的蛋白结构，并保存为pdb 格式。通过PubChem 数据库下载大豆苷元、芦丁、胡椒碱、白藜芦醇、杨梅素、苦参碱、槲皮素、黄体酮、染料木素、大黄素的3D 化学结构，保存为sdf 格式，通过OpenBabe2.4.1 将其转换为mol2 格式，再利用AutodockTools1.5.7 转换为pdbqt 格式文件。利用pymol 软件将靶点蛋白结构去除水分子、提取配体、确定对接box 大小和去除杂质，再利用AutodockTools1.5.7 加氢、加电荷并保存为pdbqt 格式文件。运用Autodock vina 进行分子对接。一般认为，结合能＜−5.0 kcal/mol （1 kcal ＝4.2 kJ ）时，说明化合物与靶点之间具有较强结合活性；当结合能＜−7.0 kcal/mol 时则表示两者之间有强烈结合活性。分子对接结果显示，得到的天然活性成分与核心靶点结合能均＜−5.0 kcal/mol ，提示两者之间具有较强活性（表2 ）。利用Discovery studio 将对接结果可视化处理，将结合能＜−7.0 kcal/mol 的对接结果导出，得到相互作用3D 图（图5 ）。
3 讨论
UC 已被世界卫生组织列为现代难治病之一，其病程漫长、迁延不愈，且极易癌变，给患者的工作和生活带来很大的痛苦[19] 。现代医学治疗UC 主要通过激素、磺胺类药、免疫抑制剂等药物控制其 症状，但存在耐药、不良反应大、易反复等问题，中药治疗 UC 的疗效佳，不易产生不良反应。铁死亡是一种不同于坏死、凋亡以及其他具有细胞死亡典型特征的致死途径，多项研究表明铁死亡在炎症中发挥着重要作用，并且铁死亡过程中多伴有炎症反应 [20] ，但目前鲜有从铁死亡角度探讨 UC 发病机制的研究。本研究从铁死亡探讨 UC 活动期与缓解期发病机制的异同，并筛选得到治疗 UC 的天然活性成分，为 UC 的临床治疗提供参考。
本研究通过生物信息学分析筛选得到干预铁死亡治疗 UC 的靶点有 IL6 、 IL1β 、 CD44 等。 UC 中许多常见的免疫反应受炎症细胞因子介导，炎症因子在肠道炎症持续过程中发挥着主导作用。在肠黏膜中促炎细胞因子与肠道生态关系密切，促炎细胞因子如 IL-6 、IL-1 等的过度产生导致肠道内环境紊乱是促使UC 发生的重要环节。IL-1β 分泌过多可激活树突样细胞、促进IL-2R 过表达，加重结肠黏膜局部的炎症反应[21] 。研究表明IL-1β 可诱导中性粒细胞和单核细胞分泌和释放前列腺素、白三烯等炎性物质，促使肠黏膜充血水肿、变性坏死，最终糜烂，形成溃疡，同时IL-1β 能介导巨噬细胞产生IL-6 、IL-8 、肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α ，TNF-α ）使炎症细胞聚集导致肠道发生损伤、隐窝脓 肿等病变 [22] 。铁死亡与炎症细胞因子关系密切，其过程多伴有炎症的表现，细胞通过铁死亡分泌强烈激活固有免疫系统的因子，发挥调控细胞炎症、信号转导和细胞生长的作用，当炎症反应超过一定限度时，大量释放促炎细胞因子 [23] 。本研究发现 IL-6 为 UC 活动期的上调基因，但在 UC 缓解期中差异表达不大， log2FC 值较小，故推测降低 IL-6 的水平可缓解 UC 活动期的症状，但对 UC 缓解期的影响不大，此观点与厉洁等 [24] 的研究结果一致。
CD44 是一种细胞黏附分子，与炎症过程关系密切。UC 的肠道炎症主要是白细胞浸润到肠壁，而CD44 在炎症细胞的浸润中起着重要作用。CD44 可以反映UC 的严重程度，其通过激活淋巴细胞，参与淋巴细胞归位到淋巴组织，引起T 淋巴细胞活化，参与炎症反应[25] 。炎性细胞因子的过度分泌可使CD44 等细胞黏附分子表达上调。
神经退行性疾病信号通路是 UC 活动期与缓解期共同相关的信号通路，其基本过程包括氧化应激和自由基形成、ER 应激等与铁死亡相关的过程，铁死亡可通过形成自由基等过程介导IEC 死亡从而导致UC[14] 。反应性星形胶质细胞增生是神经退行性疾病的特征性病理性改变之一，IL-1β 已被证实在神经退行性疾病中介导反应性星形胶质细胞增生，有研究发现神经元和胶质细胞的功能与UC 的炎性反应相关[26-27] 。脂质和动脉粥样硬化信号通路是UC 活动期特有的信号通路。铁死亡与脂质代谢异常、动脉粥样硬化关系密切，铁超载可导致血管内皮细胞遭受ROS 和脂质过氧化的损伤，使动脉粥样硬化中内皮细胞发生铁死亡，加重了动脉粥样硬化的发展[28] 。UC 患者的颈动脉内膜中层厚度明显高于健康人[29] 。IL-6 促进巨噬细胞摄取低密度脂蛋白，加速脂质沉积并促进泡沫细胞形成，IL-6 会引起CD44 高表达，正反馈促进巨噬细胞分泌IL-6 ，进而加剧动脉粥样硬化的进展。有研究发现UC 活动期患者脂质代谢异常[30] ，在UC 活动期，大量IL-1β 合成和释放，单核细胞、巨噬细胞聚集于肠黏膜，ROS 大量生成，脂质过氧化产物生成明显增加[31] 。
大豆苷元是大豆生长过程中形成的次生代谢产物，是大豆中重要的功能活性成分之一，可抑制细胞中 IL-6 的表达，并且对肠道炎症损伤具有保护效果[32-33] 。芦丁是一种来源很广的黄酮类化合物，有研究表明芦丁能降低IL-1β 和IL-6 含量，阻断其介导的炎症级联反应而减轻UC 病情[34-35] 。胡椒碱是一种源自 荜茇 的生物碱，表现出多种生物活性，如解热、抗炎等作用。有研究发现以胡椒碱为主要成分的复方能显著改善葡聚糖硫酸钠诱导的UC 小鼠的临床症状，缓解小鼠结肠充血、水肿、溃疡和炎性细胞浸润等症状，同时减少小鼠结肠组织中IL-6 的含量[36] 。白藜芦醇是一种生物活性很强的多酚类化合物，具有很好的抗氧化和抗炎作用[37] ，将其作为补充剂治疗UC 患者，疗效稳定。白藜芦醇能显著降低大鼠肠道炎症模型中IL-1β 、IL-6 的含量[38] 。杨梅素是一种天然黄酮类的化合物，其可以增加小鼠结肠组织中的抗氧化能力，并降低组织中的IL-1β 、IL-6 的水平[39] 。苦参碱是苦参的主要有效成分，还存在于山豆根、菟丝子、北豆根、槐角等中药中，能抑制炎症介质释放。苦参碱可诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期，降低CD44 、CD54 等细胞黏附分子表达[40] 。苦参碱对溃疡损伤有明显修复作用，可通过调节肠黏膜IL-6 、IL-1β 等细胞因子失衡等过程干预UC 发病过程[41] 。槲皮素是一种广泛存在于自然界的天然黄酮类化合物。以槲皮素为主要成分的复方可以改善UC 模型小鼠脓血便症状，缓解小鼠结肠缩短、血便、水肿、溃疡等炎症症状，对肠黏膜屏障有一定修复作用，同时减少小鼠结肠组织中IL-6 的含量[42] 。黄体酮存在于自然界，同时也是人体内的一种类固醇激素，对UC 的发展起到抑制作用[43] ，分子对接结果显示，其与IL-1β 结合最为紧密，发挥作用的可能性最大。染料木素是一类植物雌激素，具有酪氨酸激酶抑制活性，可发挥抗氧化、抗炎等作用。研究者发现染料木素能降低结肠炎小鼠的疾病活动指数、结肠大体形态损伤指数，同时减轻小鼠肠壁炎症细胞浸润，降低IL-1β 水平[44] 。大黄素作为自然界中广泛存在的一种羟基蒽醌类化合物，能修复、保护肠道屏障，改善UC 病理损伤，抑制肠道局部炎症[45] 。有研究将“大黄酸- 大黄素”联合治疗UC ，结果示IL-6 、IL1β 水平显著降低，并且减轻结肠黏膜损伤程度[46] 。
在中医看来， UC 属于“久痢”范畴，素体脾气虚弱是发病基础，感受外邪、饮食不节（洁）、情志失调等是其主要的发病诱因，病机多为湿热蕴肠、气血不调[1] 。整体观念的认识论与辨证论治的方法论是中医药学基本理论，中药治疗疾病也是多靶点作用的结果，故本研究所预测的中药应用于临床仍需要以辨证论治为前提，慎不可舍其辨证而施药。中医药在UC 的治疗过程中具有独特优势，如何利用铁死亡理论指导中医药有效防治UC 是该领域新的研究热点。本研究系统分析了铁死亡干预UC 的作用机制，并预测了调节铁死亡治疗UC 的天然活性成分。但关于上述成分能否成为治疗UC 的天然药物并明确其发挥作用的具体机制，仍需要实验探究和证明，希望为临床提供新的思路。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：龚卓之，曹 增，姚梦茜，孙梓宽，王倩影，刘 涛．从铁死亡探讨溃疡性结肠炎不同时期的发病机制及相关天然药物筛选 [J]. 中草药, 2023, 54(7):2187-2196.
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中国中医科学院研究生(中国中医科学院研究生院)
